PCR DIY (Termo-ciclatore)

La PCR (Polymerase Chaine Reaction) è una tecnica utilizzata nei laboratori di ricerca e serve, in sintesi, ad amplificare il DNA, creando milioni di copie che verranno utilizzate per l’identificazione di un particolare gene, sia in campo agroalimentare, sia in campo genetico, per determinare l’ereditarietà di una mutazione. La mia passione per le biotecnologie e l’eccessivo costo di un simile dispositivo, mi ha portato a pensare a questo progetto, completamente DIY, che tenta la realizzazione di una macchina PCR (termo-ciclatore) con una spesa inferiore a 100€.  Il progetto si basa sulle proprietà di degradazione del DNA ottenute grazie all’aumento di temperatura: verrà usato un termistore (o una termocoppia), interfacciato con un amplificatore e Arduino. In questo modo la temperatura verrà innalzata di parecchi gradi avendo anche una buona conducibilità permessa dall’alluminio. 

Come da preambolo, la PCR consiste di 3 passaggi fondamentali che avvengono in un lasso di tempo minimo, circa 20~30s, a temperature che vanno dai 60 ai 94°C:
Denaturazione (~94°C)
Annealing (~60°C)
Allungamento (~72°C)
 
Tenendo conto di questi parametri, il mio progetto si basa sulla costruzione di una PCR con struttura cubica in alluminio rivestita internamente da nastro, anch’esso in alluminio, per non rischiare alte temperature al contatto esternamente. 
Come materiale occorrente, il mio proposito era quello di usare:
 
  • un blocco di alluminio, si possono utilizzare i normali dissipatori termici che si trovano facilmente nei computer sopra schede video e/o CPU;
  • una termocoppia con amplificatore affine del tipo MAX31855 (circa 15-20€), tipo questa o, da testare, utilizzare l’accoppiata tra le board Temperature sensor 1.1+ PWM Driver 1.1 (utilizzate per la costruzione di un estrusore per una stampante 3D), i cui schemi di entrambe sono reperibili sulla pagina wiki della RepRap:

    Temperature sensor 1.1 qui
    PWM Driver 1.1 qui

  • una ventola da 12mm, reperibile in un qualsiasi pc;
  • 2 resistenze a filo 150ohm/50W;
  • un relay  25A AC/DC SSR (qui)
  • un transistor del tipo TIP120 a 12V
  • un trsformatore 12V 0.5A
  • Arduino (o Arduino mini) o un'altra board
Analizzando la soluzione termocoppia-amplificatore con le due resistenze e il relay, più facile da realizzare, si andrà a collegare il relay, la ventola, il cavo di alimentazione volante, le due resistenze e la termocoppia secondo questo schema: 
 
In sostanza, Arduino, in base alla fase della reazione in corso, andrà ad attivare il relay, alimentato esternamente tramite rete domestica, che inizierà a scaldare le due resistenze a filo fino alla temperatura utile per i vari passaggi. La temperatura è tenuta sotto controllo grazie alla termocoppia ed all’amplificatore MAX31855 e, per dissipare al meglio il calore, c’è la presenza di una ventola 12mm, alimentata a 12V grazie al trasformatore, posta su un lato della struttura cubica in alluminio.
 
La struttura descritta nello schema mostrato precedentemente, va montata intorno al blocco di alluminio che sarà stato forato sulla sua superficie superiore, per permettere l’alloggiamento di diverse provette (Eppendorf) da 1.5mL. Le due resistenze andranno posizionate, opposte, sulle facce laterali del blocco per permettere l’aumento di temperatura del blocco e quindi del campione.
 
Fatti tutti i collegamenti, bisognerà caricare il programma su Arduino, o altra board. Il programma da implementare dovrebbe essere questo indicato di seguito e, probabilmente, servirà anche l’utilizzo della libreria max6675, reperibile qui :
boolean holdConstanTemp (long duration, double idealTemp) {
       unsigned long startTime = millis();
        long timeElapsed = millis() – startTime;
//tiene traccia del tempo trascorso
      while (timeElapsed < duration) {
     curTemp = thermocouple.readCelsius();
     printTempStats(startTime);
              if (curTemp < idealTemp) {
//aumenta la temperatura per 90ms se è bassa
                 digitalWrite(heatPin, HIGH);
                 delay(90);
                 digitalWrite(heatPin, LOW);
       }        else if (curTemp > (idealTemo+0.5)) {
// aumenta giri ventola se temperatura è alta e non accendere
// ventola se all’interno ci sono meno di 0.5°C                                                    
                   digitalWrite(fanPin, HIGH);
                   delay(90);
                   digitalWrite(fanPin, LOW);
       }
                   delay(210);
                   timeElapse = millis() – startTime;  
   }  
             returne true;
}

Come primo test si può collegare la macchina ad un pc e utilizzare ad esempio dell’olio minerale come campione e, successivamente, comprare un kit per PCR da analizzare in vendita su alcuni siti specializzati.

 
Il progetto in questione sembra all’apparenza difficile ma è di facile realizzazione con un po’ d’impegno, anche con materiali a basso costo tipici dello spirito DIY. Purtroppo non ho ancora avuto modo di testarne il funzionamento per la mancanza di una board, è tutto ancora teorico, ma spero al più presto di verificarne l’efficienza, aggiornando anche questo articolo.
Il progetto nasce dal mio desiderio di avere una PCR, in puro stile Biotech, mondo del quale faccio parte, e dall’impossibilità, dati gli enormi costi, di comprarne una. Così ho voluto ridurre al minimo la struttura di altri modelli di questa macchina già esistenti nel mondo OpenSource (vedere OpenPCR), modelli più dispendiosi nella realizzazione e nei costi, per poter avvicinare altre persone che magari seguono la mia stessa passione.
Per concludere, essendo il mio un progetto completamente Open, sono ben accetti consigli e idee per migliorarne la realizzazione.
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3 Comments

  1. arachide1 16 dicembre 2013
  2. CristianPadovano 17 dicembre 2013

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